《中华实验外科杂志》2018年10月第35卷第10期
干扰素-γ联合聚桂醇抑制血管瘤内皮细胞增殖促进其凋亡的研究
【276023 山东省临沂市第三人民医院肿瘤科(刘学键、文阳章、李玉花、陈香利、武霞、杨汶川)；276001 山东省，临沂市肿瘤医院血管瘤特色专科(邰茂众)；200011上海交通大学附属第九人民医院血管外科(郑家伟)】
摘要：
目的：探讨干扰素(IFN)-γ和聚桂醇对血管瘤内皮细胞增殖、凋亡、侵袭、迁移的影响以及作用机制。
方法：不同浓度的IFN一γ和聚桂醇干预48h，噻唑蓝(MTT)法、流式细胞术检测细胞增殖、凋亡，细胞划痕实验和Transwell小室法检测细胞的迁移和侵袭能力，Western blot分析B细胞淋巴瘤／白血病-2(bcl-2)相关X蛋白(bax)、bcl-2、活化的天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶9(Cleaved Caspase-9)蛋白的表达。
结果：不同浓度聚桂醇、IFN-γ显著抑制血管瘤内皮细胞增殖；与0μg／ml或0μg／L(0.836±0.088；0.809±0.062)比较差异有统计学意义(t聚桂醇20μg/ml=2.952，P聚桂醇20μg/ml=0.042；t聚挂酵30μgml=4.588，P聚桂醇30μg/ml=0.010；t聚桂醇40μg/ml=7.351，P聚桂酵40μg/ml=0.002；t聚桂醇50μg/mI=12.939，P聚桂醇50μg/ml=0.000；tlFN一γ20μg/L=3.720，PIFN-γ20μg/L=0.021；tIFN-40μg/L=4.684，PIFN-γ40μg／L=0.009；tlFN- 60μg／L=9.539，PIFN-γ60μg/L=0.001；tIFN-γ80μg/L=14.039，PlFN-γ80μg／L=0.000)；选取聚桂醇、IFN-γ最适浓度(30μg／ml、40μg／L)进行后续实验。联合使用诱导凋亡、抑制迁移和侵袭作用更明显(P凋亡=0.000、P迁移=0.000、P侵袭=0.000)，降低bcl-2蛋白、增加bax、Cleaved Caspase-9蛋白。
结论：IFN-γ和聚桂醇能够抑制血管瘤内皮细胞增殖，诱导细胞凋亡，降低其侵袭、迁移能力，可能是通过下调bcl-2表达，上调bax、Cleaved Caspase-9表达而实现的。
关键词：
干扰素-γ1；聚桂醇；血管瘤内皮细胞；B细胞淋巴瘤／白血病-2
血管瘤是一种发生在婴儿时期的良性肿瘤，是皮肤血管内皮细胞异常增生导致的血管瘤。我们以血管瘤内皮细胞为基础，观察干扰素-γ(IFN-γ)和聚桂醇对血管瘤细胞生物学特性的影响，探讨其作用机制。
一、材料与方法
1.1 材料
人血管瘤内皮细胞购自美国美国模式菌种收集中,6／美国生物标准品收藏中心(ATCC)细胞库，M199培养基购自美国赛默飞世尔公司，IFN-γ购自美国R&D公司，聚桂醇购自陕西天宇制药有限公司，B细胞淋巴瘤／白血病-2(bcl一2)抗体、bcl-2相关X蛋白(bax)抗体、β肌动蛋白(β—actin)抗体、活化的天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶9(Cleaved Caspase-9)抗体购自美国Cell Signaling Technology公司。
1.2 细胞培养
加入M199培养基，置于37℃、5％CO2、100％湿度的培养箱中培养，每天观察细胞的生长状态。
1.3 实验分组与细胞的干预
分为对照组、IFN-γ组、聚桂醇组、联合组。IFN-γ作用浓度分别为0、20、40、60、80μg／L，聚桂醇作用浓度分别为0、10、20、30、40、50μg／ml，作用时间为48 h。经检测确定最佳作用浓度，IFN-γ+聚桂醇组的作用浓度为最佳作用浓度相加，每组5个复孔。
1.4 细胞增殖测定
根据噻唑蓝(MTF)试剂盒说明书进行操作，实验组与对照组吸光值的比值即为细胞存活率。
1.5 细胞凋亡测定
根据膜联蛋白V—FITC(Annexin V—FITC)／碘化丙锭(PI)试剂盒说明书进行操作，每组5个复孔。
1.6 细胞迁移能力测定
用无菌的10μl枪头在单层细胞上均匀划痕，各组加入实验所需的药物，继续培养24 h，测量0、24 h的划痕宽度，计算细胞迁移率。细胞迁移率(％)=(0 h划痕宽度一24h划痕宽度)／0h划痕宽度×100％。
1.7 细胞侵袭能力测定
将3×105个细胞采用无血清培养基培养，加入上室，培养24h，棉签轻轻拭去上室膜表面细胞，在400倍倒置显微镜选取5个视野进行计数，取平均值，每组5个复孔，实验重复3次。
1.8 细胞中bcl-2、bax、Cleaved Caspase-9蛋白含量
加入适量细胞裂解液，变性，加样，电泳，将蛋白转移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，1％封闭液4℃封闭过夜，加入一抗，室温反应1h，三羟甲基氨基甲烷缓冲盐水(TBS／T)洗膜3次，每次5min，加人二抗，室温反应1h，Tris—HCI缓冲液(TBST)清洗3次，每次5min，凝胶成像系统分析蛋白灰度值。
1.9 统计学方法
应用SPSS20.0统计软件分析，多组间比较采用单因素方差分析，两样本差异使用LSD-t检验，计量资料以均数±标准差(-x±s)表示，以P<0.05为差异有统计学意义。
二、结果
2.1 IFN-γ联合聚桂醇对血管瘤内皮细胞增殖的影响
IFN-γ、聚桂醇对细胞的增殖抑制作用具有浓度依赖性；20μg／L(0.631±0.055)、40μg/L(0.550±0.073)、60μg／L(0.330±0.061)、80μg／L(0.202±0.042)IFN-γ对细胞的增殖抑制作用具有浓度依赖性；10μg／ml(0.762±0.068)、20μg／ml(0.631±0.082)、30μg/ml(0.543±0.067)、40μg／ml(0.364±0.068)、50μg/ml(0.165±0.018)聚桂醇处理细胞后细胞增殖受到不同程度的抑制；与0μg／L(0.809±0.062)或0μg／ml(0.836±0.088)比较差异有统计学意义 (tlFN-γ20μg/L= 3.720，PIFN-γ20μg／L=0.021；tIFN-γ40μg/L=4.684，PIFN-γ 40μg／L=0.009；tlFN-γ60μg/L=9.539，PIFN-γ 60μgL=0.001；tlFN-γ80μg/L=14.039，PIFN-γ80μg/L=0.000；t聚桂酵20μg／ml=2.952，P聚桂醇20μg／ml=0.042；t聚桂醇30μg／ml=4.588， P聚桂醇30μg／ml=0.010；t聚桂醇40μg/ml=7.351，P聚桂醇40μg／ml=0.002；t聚桂醇50μg/ml=12.939，P聚桂醇50μg/ml=0.000)。选取聚桂醇、IFN-γ最适浓度(30μg／ml、40μg／L)联合作用时，对照组、IFN-γ／(40μg／L)、聚桂醇(30μg／ml)组、IFN-γ+聚桂醇组细胞的存活率分别为(99.845±0.063)％、(48.320±3.669)％、(46.126±4.625)％、(83.267±5.279)％，与对照组比较细胞的存活率显著增加(tIFN-γ40μg/L=24.320，PIFN-γ40μg／L=0.000；t聚桂醇30μg／ml= 20.116，P聚桂酵30μg/ml=0.000；tIFN-γ+聚桂醇=5.439，PIFN-γ+聚桂醇=0.006)。
2.2 IFN-γ联合聚桂醇对血管瘤内皮细胞凋亡的影响
与对照组[(5.321±0.855)％]比较，IFN-γ组[(33.298±4.522)％]与聚桂醇[(29.416±3.465)％]单独使用均可显著促进血管瘤内皮细胞凋亡 (tIFN-γ40μg/L= 10.530，PIFN-γ 40μg/L=0.001；t聚桂醇30μg／ml=11.694，P聚桂醇30μg／ml=0.000)；联合使用[(48.756±5.896)％]，细胞凋亡率增加(tIFN-γ+聚桂醇=12.628，PlFN-γ+聚桂醇=0.000)。
2.3 IFN-γ联合聚桂醇对血管瘤内皮细胞迁移的影响
与对照组[(36.456±3.523)％]比较，IFN-γ[(24.236±2.629)％]或聚桂醇[(25.368±2.452)％]单独使用时血管瘤内皮细胞的迁移率显著降低(tIFN-γ40μg／L=4.815，PIFN-γ40μg/L=0.009；t聚桂醇30μg/ml=4.474，P聚桂醇30μg/ml=0.011)；联合使用[(12.489±1.023)％]，细胞迁移率显著降低(tIFN-γ+聚桂醇=11.316，PIFN-γ+聚桂醇=0.000)。
2.4 IFN-γ联合聚桂醇对血管瘤内皮细胞侵袭的影响
与对照组[(45.269±5.258)个]比较，IFN-γ组[(26.785±3.689)个]和聚桂醇组[(22.146±2.752)个]血管瘤内皮细胞的侵袭数显著降低(tlFN-γ40μg/L=4.984，PlFN-γ40μg／L=0.008；t聚桂醇30μg/ml=6.749，P聚桂醇30μg=0.003)；联合使用[(11.863±1.247)个]，细胞侵袭数显著降低(tIFN-γ+聚桂醇=10.707，PIFN-γ+聚桂醇=0.000)。
2.5 IFN-γ联合聚桂醇对血管瘤内皮细胞中bcl-2、bax、Cleaved Caspase-9蛋白的影响
与对照组比较，IFN-γ组、聚桂醇组血管瘤内皮细胞中bcl-2蛋白的表达量显著降低(t1=3.013，P1=0.040，t2=2.952，P2=0.042)，bax蛋白(t1=2.870，P1=0.046；t2=2.793，P2=0.049)和Cleaved Caspase-9蛋白(t1=4.205，P1=0.014；t2=4.271，P2=0.013)的表达量显著增加；与IFN-γ+聚桂醇组比较，IFN-γ或聚桂醇单独使用显著下调bax(t1=3.201，P1=0.033；t2=4.430，P2=0.011)、Cleaved Caspase-9(t1=5.342，P1=0.006；t2=5.043，P2=0.007)，增加bcl-2(t1=5.060 ，P1=0.007；t2=5.899，P2=0.004)，见图1。
三、讨论
研究表明血管瘤的消退过程与内皮细胞增殖、凋亡等生物学特性有关[1]。激素联合干扰素治疗严重血管瘤的效果优于单独使用。本研究结果显示，IFN-γ和聚桂醇干预的血管瘤内皮细胞的存活率、侵袭数、迁移率显著低于对照组，凋亡率显著升高，说明IFN-γ和聚桂醇能够抑制血管内皮细胞的增殖，诱导其凋亡，同时降低细胞的侵袭、迁移能力，从而促进血管瘤消退，联合使用效果更好。
血管瘤内皮细胞的增殖、凋亡的平衡是维持血管功能与形态的重要因素。bcl-2可抑制细胞色素C的表达，从而阻碍Caspase蛋白酶的活化，降低了细胞的凋亡率。但bax可促进细胞色素c进入线粒体，促进Cleaved Caspase-9的生成，进而激活Caspase-3和Caspase-7，起到促进凋亡的作用[2-3]。本实验结果表明IFN-γ和聚桂醇处理血管瘤内皮细胞促进CleavedCaspase-9、bax蛋白的表达，降低bcl-2蛋白水平，与细胞增殖、凋亡结果一致，表明IFN-γ和聚桂醇诱导血管瘤内皮细胞凋亡可能与Cleaved Caspase-9、bax蛋白高表达、bcl-2蛋白低表达有关。
